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    PCR实验中试剂为什么会蒸发?甚至蒸干?怎么办—“东东" "龙龙"问题答疑专栏(7)

    发布时间:2023/12/27

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     问题诊断

                

     

    东东:请问PCR实验中试剂为什么会蒸发?甚至蒸干?怎么办?

    龙龙:试剂的蒸发是PCR实验中常见的问题之一,影响试剂蒸发的因素也比较多。

     

           蒸发是指试剂在PCR实验过程中,反应液在高温下气化,又凝结在管壁或顶盖上,形成水雾或水珠,或直接从管盖或覆膜的气隙中逸出,造成反应液浓度变化、反应液量减少,有的甚至蒸干,导致实验无效等。

          

    在PCR实验中,我们一般通过加热盖的办法来防止试剂蒸汽的凝结,热盖温度一般比反应液的温度高,以防止蒸汽凝结。

          

    对于蒸汽的泄漏,大部分人认为是热盖的压力不够所致。热盖的压力固然很重要,但这仅仅是一个方面,其实耗材也很关键。

          

    优质的试管,管口和盖子表面光滑,盒盖后密封性好,不易泄漏。而劣质耗材,管口不平,有径向纹路,容易造成泄漏,甚至蒸干。

          

           对于小体系(5-10ul)的PCR反应,大多采用96孔板进行实验。96孔板一般都采用覆膜的方式来密封,也有用硅胶盖的。如果是覆膜,塑料膜的材质、厚薄、硬度、覆膜的温度、压力、平整度等都有影响。一般选择质地柔软的、厚度较厚的膜较好。为了增加管口的密封压力,还可在热盖上增加一个柔软的、带96个凸起的硅胶垫。

          

           另外,PCR程序的参数设置也很重要,要选择与实际反应体系最接近的反应体系。如:实际反应体系是5ul,如果在程序设置时选择了25ul、甚至50ul,那么,试剂在95℃裂解时的温度过冲大,且动态温度平衡时间会延长。这实际上是提高了试剂的温度(可能达到98℃),并且延长了在高温段停留的时间,大大增加了试剂泄漏的风险,甚至使试剂完全蒸发(蒸干)。

     

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