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实时荧光定量PCR仪-入门必备术语 1
发布时间：2021/09/26
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1. RT-PCR，qPCR，Real-time PCR，RT-qPCR区分
RT-PCR:
就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。
qPCR、Real-time-PCR:
其实 Rea-ltime-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。
虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和 Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）
real-time RT-PCR（或RT-qPCR）:
real-time RT-PCR中间的“RT”是 reverse transcription（逆转录），整个意思就是利用 mRNA 或 总RNA 为模板的实时逆转录PCR技术（quantitative Real-time RT-PCR）。real time RT-PCR指的是 qPCR+RT-PCR的组合，是说将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR分析，因为RT-PCR是可以定性的，但不能进行定量检测的。
2. SYBR Green I染料法
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，其不会与单链DNA结合，且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。
3. Taqman探针法
PCR扩增时，将一对引物、特异性的TaqMan探针（5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团）与模板DNA混合，开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，遵守聚合酶链反应规律，经过高温变性-低温复性-适温延伸的热循环，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光，随着循环次数的增加，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
4. 绝对定量（Absolute Quantification）
原理：根据标准曲线对未知样品进行的定量。
举例：可以通过qPCR计算出待测样本的初始拷贝数，如1ml血液里有多少个HBV病毒。可根据病毒的拷贝数，监控疾病状态。
5. 相对定量（Relative Quantification）
原理：用于分析特定样品相对于参照样品某个基因表达量的变化。
举例：用于检测药物引起的基因表达改变，将经药物处理样品的特定目标基因的表达水平相对未处理样品的基因表达水平进行比较。
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