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SHANGHAI SUNSHINE BIOTECH CO.，LTD.

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    PCR 条带弱 4步排查法

    发布时间：2021/09/26

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    从 PCR 反应的关键环节入手，我们可以发现 PCR 经常会在「酶的质量」「引物」「mix」「反应体系与温度」上出现错误，因此原因也应该在这些环节基础上，进行分析排查。
     

    酶失活的原因

    需要更新酶，或者新旧两种酶同时使用，分析是否因酶的活性丧失或不够而导致的假阴性。需注意，有可能是忘记加 Taq 酶或溴乙锭。

     

    引物出现问题

    引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增的条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

     

    mix 与镁离子浓度

    镁离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。

     

    反应体系与温度设置

    通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20μL、30μL、50μL 或 100μL，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20μL 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

     

    变性对 PCR 扩增来说，也相当重要。

    如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。

    最后，靶序列发生突变或缺失，则会影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。

     

    以上就是 PCR 条带弱的 4 个常见原因以及排查方法，你学会了吗？！！

     

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