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PCR仪常见问题及回答二
发布时间：2021/09/26
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11 什么情况下需要使用RNase H？
在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时。
12 根据不同的目的选择不同的系统
目的 建议
RT与PCR使用不同的引物
或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统
高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统
高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
13 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
＊50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）
＊23-28个碱基长度，以提高引物特异性
＊降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
14 为什么得不到RACE产物？
＊加入Hela对照
＊低质量的RNA模板
＊逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
＊目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR
＊目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
＊目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
＊cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
15 RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
＊GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
＊GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
＊RNA降解。
＊PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。
16 得不到全长的5’RACE PCR产物
＊CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
＊CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
＊PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。
17 PCR
在进行PCR时：
＊请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++
＊请确保您使用了恰当的退火温度
＊请确保您没有使用过量的DNA聚合酶
18 引物
① 应该选择哪种纯化方法？
取决于实验目的和引物的长度
②为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？
50nmol是起始量
③ 怎样制备100μM的储液？
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10
④ 怎样设计引物？
＊一般长度20-30bp；
＊至少50%的GC含量；
＊避免引物二聚体和二级结构；
＊引物对的Tm值应该接近。
⑤引物序列有插入或缺失？
＊使用上游和下游引物多测几个克隆。
＊请选择正确的纯化方法。
⑥ PCR无结果？
＊请检查引物设计是否正确；
＊请检测OD读数是否正确；
＊做一个阳性对照和一个阴性对照
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