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    PCR仪常见问题及回答二

    发布时间:2021/09/26

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    11        什么情况下需要使用RNase H?             

    在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时。

      12       根据不同的目的选择不同的系统             

    目的 建议
    RT与PCR使用不同的引物
    或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统
    高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统
    高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
    或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
    高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
    长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
    含Elongase酶的一步法RT-PCR系统

      13        如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物(GSP)             

    使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物,您在设计引物时需要注意以下几点要求:
    *50-70%的GC含量,以提高引物熔点(Tm)
    *23-28个碱基长度,以提高引物特异性
    *降低3’端GC含量,将引物非特异性结合的可能性降至最低

      14         为什么得不到RACE产物?            

    *加入Hela对照

    *低质量的RNA模板
    *逆转录失败,SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
    *目的基因丰度太低,可以通过提高PCR的循环次数来解决,建议使用巢式PCR
    *目的基因没有表达,可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
    *目的基因太长而不适合进行反转录,建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA,使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
    *cDNA模板属于困难模板,可以通过以下方法解决:优化PCR反应参数及反应体系;降低退火温度;使用5-10%的DMSO帮助通过高GC含量区;使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。

      15           RACE的PCR结果有杂带            

    RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因:
    *GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
    *GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
    *RNA降解。
    *PCR管或试剂污染。
    注意:杂带一般是因为没有优化PCR条件,可以加入阴性对照来确定。

      16           得不到全长的5’RACE PCR产物             

    *CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板,可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作,保证RNA无降解。

    *CIP脱磷酸不完全,可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
    *PCR产生了杂带,并不是真正的连接产物,可以使用上述建议优化PCR。

      17           PCR            

    在进行PCR时:

    *请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物,也没有加入过量的Mg++
    *请确保您使用了恰当的退火温度
    *请确保您没有使用过量的DNA聚合酶

      18        引物             

    ① 应该选择哪种纯化方法?

    取决于实验目的和引物的长度
    ②为什么我订购了50nmol,但是收到却只有40nmol?
    50nmol是起始量
    ③ 怎样制备100μM的储液?
    体积(μl)=质检报告上的nmol数目×10
    ④ 怎样设计引物?
    *一般长度20-30bp;
    *至少50%的GC含量;
    *避免引物二聚体和二级结构;
    *引物对的Tm值应该接近。
    ⑤引物序列有插入或缺失?
    *使用上游和下游引物多测几个克隆。
    *请选择正确的纯化方法。
    ⑥ PCR无结果?
    *请检查引物设计是否正确;
    *请检测OD读数是否正确;
    *做一个阳性对照和一个阴性对照

     

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