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解密 lncRNA 生物功能的利器：CRISPR HDR 技术
发布时间：2023/11/17
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人类基因组是一个庞大的信息库，它包含了我们体内所有的遗传信息。这些信息的表达是通过基因转录为RNA的形式来实现的。有趣的是，仅有2%的RNA转录产物能够被翻译成蛋白质。那么剩余的98%的RNA转录产物是什么呢？这些转录产物被称为非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。ncRNA与DNA、RNA或蛋白质相互作用，发挥着许多关键功能。
其中，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），是一类RNA转录本，其长度超过200个核苷酸。尽管lncRNA不编码蛋白质，但它们在细胞中扮演着非常重要的角色。
lncRNA与染色质状态的维持密切相关。通过与染色质相互作用，lncRNA能够影响基因的表达和调控。lncRNA还参与RNA的转录、稳定性以及蛋白质的合成和修饰等过程。此外，lncRNA还能够作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）和蛋白质支架来发挥功能。
总之，虽然lncRNA不编码蛋白质，但它们在基因表达和调控方面扮演着非常重要的角色。lncRNA的研究不仅有助于我们更好地理解细胞的生物学过程，也为疾病诊断和治疗提供了新的思路和方法。
目前，科研人员利用CRISPR HDR 技术，可对感兴趣的任何lncRNA基因进行敲除，而不受RNA分子细胞内定位的影响，是一种lncRNA 功能研究的重要工具。德国耶拿公司的高速PCR仪（Biometra TAdvanced96 SG)和超高分辨率的凝胶成像仪(UVP GelStudio PLUS)，能帮助科研人员在CRISPR HDR实验中完成质粒构建及扩增片段电泳后的成像并获得更好的结果。
CRISPR/Cas9是一种利用CRISPR序列和Cas9蛋白质，通过设计特定的RNA分子，实现对目标基因的定向切割和修复，并在细胞内获得稳定表达的基因编辑技术。
然而，CRISPR/Cas9技术在实际应用中还存在着许多问题。其中最为突出的问题之一就是通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）来修复Cas9切割的DNA断裂。NHEJ修复机制会导致目标基因发生随机插入、缺失等问题，从而影响到基因编辑的效果和安全性。
为了解决这个问题，发展出了一种基于同源定向修复（homology-directed repair，HDR）的CRISPR/Cas9技术。具体包括，设计合成特定的sgRNA（short guide RNA），识别并结合目标基因Protospacer 相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM），并引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂。同时，将HDR模板引入目标生物的细胞中，与目标基因序列进行重组，之后细胞利用其内在的修复机制，启动同源重组修复（homology directed repair，HDR）路径，修复目标基因的切割位点，同时将外源供体DNA定点导入至基因组靶位点，从而实现对目标基因的精确编辑。与NHEJ修复机制相比，HDR修复机制具有更高的精确性和可控性。
近年来，有研究发现lncRNA 是多细胞生物体转录组的重要组成部分，同时，lncRNA与人类疾病相关研究表明，lncRNA具有广泛的生物学功能，需要更多的功能研究来揭示它们的生物学作用。与蛋白质编码基因类似，表达抑制的方法对于研究lncRNA的生物学功能非常重要。但由于lncRNA的非编码性，相关基因组区域的改变必须足够大，才能对表达的RNA的结构和生物学功能产生影响。利用CRISPR HDR 技术可实现在转录单元的起始处整合一个强转录终止信号，导致启动子提前终止转录本，从而实现对lncRNA的敲除，进而影响其生物学功能。
德国耶拿 qTOWER3G 系列荧光定量 PCR 仪，可帮助客户高质量完成 lncRNA 敲除后mRNA表达水平检测环节。qTOWER3G 具有超高的升降温速率，在极大缩短 mRNA 表达水平的检测时间，提高实验效率的同时，超高的温度精确度和均一性以及特有的线性温度梯度，可帮助科研人员精准摸索合适的退火温度，从而极大减少 DNA 扩增过程中非特异性扩增的产生，提高PCR的特异性和保真度。
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