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    qPCR实验引物设计指南(上)—— 引物设计原则

    发布时间:2023/11/17

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    qPCR即实时荧光定量PCR实验,是当下科研实验室开展基因表达分析、基因功能研究的常用方法。然而,要做好一个qPCR实验,就需要设计出合适的引物,而设计引物也往往是科研人员比较头疼以及需要花费较多精力的一步。在本篇文章中,将和大家分享引物设计原则,具体如下:

     

    01、基因表达量变化实验引物需跨内含子设计 

    这样可以使gDNA模板不能得到扩增,去除了gDNA污染造成的影响。

     

     

     

     

    02、引物长度

          引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

     

    03、GC含量和Tm值

           引物GC含量控制在40%~60%之间。正反向引物GC含量应接近相同,以便获得相同的 Tm值和退火温度。Tm值应尽量在55~65℃之间,一般为60℃左右,上下游的∆Tm≤4℃。

     

    04、避免引物间的互补性

           引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。

     

    05、相同碱基不要连续长串排列超过3个

          引物中四种碱基的分布最好是随机的,3′端避免超过3个连续的G或C,否则容易在GC富集序列区产生配对。

     

    06、引物3′端末端避免选择A

           当末位碱基为A时,即使在错配的情况下,也能引发链合成,而当末位为T时,错配引发效率大大降低。

     

    07、科引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰学与技术

           引物的延伸是从 3′ 端开始的,不能进行任何修饰。

     

    08、扩增产物的单链不能形成二级结构

          某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

     

    09、引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位

           密码子的第 3 位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

     

    10、引物扩增的是目标特异产物

            对引物进行BLAST检测,在序列数据库中比对产物的特异性。

     

    11、定量PCR产物长度: 75~200bp

           扩增产物太长会影响到qPCR扩增效率。

           

    以上就是与大家分享的引物设计原则,老师和同学们在设计引物的时候可以进行参考。然而,并不是设计好引物就可以了,我们还需要对引物进行进一步的验证,去证明用该引物扩增出来的产物是特异的,扩增效率高,且结果是可信的。引物的验证将会在下篇进行阐述。