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如何做好蛋白磷酸化检测
发布时间：2023/11/17
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蛋白质酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，对于细胞信号传导、基因表达等生命过程具有重要的影响。因此，开发可靠的蛋白质磷酸化检测方法对于生命科学研究具有重要意义。
目前，常用的蛋白质磷酸化检测方法包括免疫印迹、质谱分析、荧光探针法等。其中，免疫印迹法是最为常用的方法之一。该方法利用特异性的抗体对目标蛋白质进行识别，再通过化学反应将蛋白质磺酸化部位与抗体结合，最终通过光学检测手段进行检测。
那通过什么手段检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平呢？最常用到的方法就是western blot，是目前最稳定可靠的检测方法。
以下就是 western blot 实验中需要重点关注的细节。
一、收蛋白样：
1、收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解；
2、蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF（抑制酸性磷酸酶），所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;
3、如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂（氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM）；
4、蛋白裂解后4℃离心后，最好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。蛋白变性后你就可以稍微心安了，不用再小心翼翼害怕磷酸化蛋白降解了。
二、转膜：
转膜的时间根据磷酸化蛋白的大小，分子量大时间就长点；分子量小，时间就短点，不可转膜不完全，也不可把膜转过头了。这样都将导致磷酸化蛋白量少，条带过淡。
三、封闭：
1、常温封闭即可，转速不可过高，40-50转即可；
2、做一般蛋白的话，我们常用5%的脱脂奶，但如果做磷酸化的蛋白，最好用5%的BSA。
四、抗体：
1、一定选大公司的抗体，比如CST，毕竟磷酸化蛋白不好做，以免费时费力，小心翼翼很多步，最后毁在抗体上，得不偿失；
2、一抗最好4度过夜，确保抗体充分的结合；
3、二抗正常室温2h，转速不可过大；
4、做磷酸化蛋白，最好总蛋白水平也跑一下，因为到时候发文章评委也会提这样的问题，避免以后补实验，不要给自己找麻烦啊！这是为什么呢？评委难为我，No, No, No!那是因为总蛋白水平包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，蛋白的磷酸化激活是体内磷酸化蛋白占总蛋白的比值，而不是单一看磷酸化蛋白的表达，需确定磷酸化蛋白的改变是因为某种作用下总蛋白表达的变化所引起的，还是因为蛋白激酶活化磷酸化蛋白水平增加而引起的。
五、曝光：
加ECL显影剂，如果条带过淡，可延长曝光时间；如果杂带过多影响目的条带的额曝光，可遮住杂带部分再次曝光。
六、在整个实验流程中最最重要的就是成像环节，仪器的好坏直接影响实验结果。
UVP ChemStudio PLUS/UVP ChemStudio PLUS Touch 超敏全能型成像仪拥有优异的性能，将是您 WesternBlot 实验不可或缺的得力助手。
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