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qPCR实验引物设计指南（下）—— 引物的验证
发布时间：2023/11/17
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在qPCR实验引物设计指南（上）中列出了引物设计的原则。那么，要怎么去确定设计出来的引物可以做出扩增产物特异性好，扩增效率高，实验结果可信的qPCR实验呢？
在进行基因表达分析、基因功能研究的时候，常用的是染料法，而染料法的特点是在完成扩增程序后会添加熔解曲线步骤来验证扩增产物的特异性，当熔解曲线呈现单一且尖锐的峰，证明扩增产物特异性好，反之，则产生了非特异性扩增（图1.）。
图1. A和B是在德国耶拿qTOWER3系列荧光定量PCR仪上做的熔解曲线，其中A图呈现尖锐的单峰，具有良好的产物特异性；B图可以看出熔解曲线呈现非单峰，且在主峰出现前出现了另一个峰，说明产生了引物二聚体。
关于验证扩增效率，我们可以通过做标准曲线算出扩增效率，如图2所示，该标准曲线是通过德国耶拿 qTOWER3 系列荧光定量 PCR 仪扩增并其软件 qPCRsoft 进行拟合计算。当曲线呈现良好的重复性并且扩增效率E达到 90-110% 的时候，说明扩增效率良好。
图2. 图中的标曲以及数据是由德国耶拿 qTOWER3 系列荧光定量PCR仪扩增并且通过该设备软件 qPCRsoft 进行拟合分析，由图可示每个浓度重复性良好，R2 大于0.999，扩增效率达到99%。
当然，引物验证实验并非做一次成功就可以了。我们需要多次重复验证，这也需要进行验证的荧光定量PCR仪性能稳定，才能得出可信的实验结果。特别是低表达的基因，对荧光定量PCR仪的要求就不仅仅是要性能稳定，更是要高灵敏度的检测器。德国耶拿的qTOWER3系列荧光定量PCR仪采用的是全新的高灵敏度通道式光电倍增管（CPMT），具有级联放大作用，灵敏度高，且采用高强度，长寿命的RGBW四色LED光源，和优秀的温度控制系统，保证了实验的稳定性和可信度，可以很好地协助科研老师做出稳定灵敏的qPCR结果。
另外，德国耶拿还提供带温度梯度功能的荧光定量PCR仪（qTOWER3G系列），拥有独特的线性温度梯度功能，可设置12个不同的温度点进行退火温度，通过看Ct值以及荧光信号强度判断引物最优的退火温度。
如图3所示，相同的样品，反应体系，耗材以及相同的程序但是退火温度不同，在12个不同的退火温度下可看出其扩增结果不同，应取Ct 值小、扩增信号高的样品对应的退火温度为引物的最适退火温度。
图3. A展示的是样品排列方式以及退火线性温度设置，B为不同退火温度下样品的扩增曲线，其中，Ct值最小且荧光信号高所对应的退火温度为引物的最适退火温度。所有设置以及结果的呈现都在德国耶拿荧光定量PCR仪软件qPCRSoft 4.1中完成。
以上就是qPCR实验引物设计指南的全部内容了，祝大家在qPCR实验中可以做出满意的结果！
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