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荧光定量PCR仪，结果分析相关术语
发布时间：2023/07/03
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1. 扩增子（Amplicon）
PCR过程扩增产生的DNA短片段。
2. 扩增曲线（Amplification Plot）
PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光信号为纵坐标制作的曲线。（如下图所示）扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。
3. 基线（Baseline）
基线是早期循环的噪点水平，通常在第3~15循环之间测量，这是因为在此期间还检测不到扩增产物引起的荧光值增加。用于计算基线的循环数量是可以改变的，如果使用高模板量或者靶标基因的表达水平高则循环数量需要减少。
4. 本底信号
即样本的荧光背景值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，可通过算法去除。
5.荧光阈值（Threshold）
阈值调整到本底值之上并显著低于扩增曲线的平稳值。它必须处于扩增曲线的线性区域内，代表了PCR检出的对数线性范围。阈值应在对数扩增曲线视图中进行设置，以使PCR的对数线性期易于识别。如果Real-Time PCR中有多个目标基因，阈值必须为每个目标进行设定。一般将 PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR前3~15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。一般来说，每台仪器在使用前都已经设置好了荧光阈值。
6.循环阈值（Cycle Threshold, Ct值）
Ct值是指在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值与模板的拷贝数存在线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小。
7.惰性参比染料（ROX）
用作荧光信号标准化内部参照，可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。通常，不同仪器有不同ROX需求，目前国产仪器基本无需ROX校准要求。
8.均一化报告基团（Rn）
荧光染料报告基团（Reporter, R）释放的荧光强度除以惰性参比染料的荧光强度。
9. ΔRn
在特定PCR条件设置下所产生的信号量级。ΔRn=(Rn+) – (Rn-)，Rn+: 一次反应的Rn值，Rn-：未反应样品的Rn值。
10.熔解曲线（Melting curve）
qPCR扩增完成后，对PCR产物加热，随温度升高，DNA逐渐解链，导致荧光强度下降，当到达某一温度时（Tm），会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，对PCR的特异性进行鉴定。
11.熔解温度（Tm）
DNA双链解链一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
12.对数曲线（logarithm curve）
对熔解曲线取对数，形成峰图，更直观的显示PCR产物片段的情况。通常根据引物设计原则，扩增产物长度在80-300 bp范围内，熔解温度在80℃-90℃之间。
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