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QPCR相对定量和绝对定量相关术语
发布时间：2023/07/03
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一、相对定量相关术语
1.内参（Internal reference）
在同一反应中被作为靶序列扩增，并用不同的探针（即，进行双重PCR）检测的对照序列。内参经常被用来排除失败的扩增，例如没有检测到目标序列的情况。
2.内参基因（Reference gene）
内源性参比基因的表达水平在样品间不存在差异，如管家基因（Housekeeping genes, HKGs），常用GAPDH、β-actin 、18SrRNA和28S rRNA等。
3.标准样品（Standard Sample）
相对定量中使用的参比样品，用与其他样品进行比较，确定某一基因的相对表达水平。
4.阳性对照（Positive Control）
使用已知量模板的对照反应。阳性对照通常用来检查引物集或引物–探针集工作是否正常，以及反应是否正确设置。
5.阴性对照（Negative Control）
重要的阴性对照包括无模板对照（No template control，NTC）和无反转录酶对照（No reverse transcriptase control，NRC）。
NTC：包含除模板之外的所有扩增反应所必要组分的对照反应，模板通常用水代替，用于检测试剂污染或外源DNA造成的污染；
NRC：在反转录的时候多配制一个体系，不加反转录酶，其余成分正常添加，在相同的反转录过程下获得的产物，以此为模板，观察扩增情况，用于检验cDNA中是否有基因组DNA的污染。
二、绝对定量相关术语
1.标准品（Standards）
标准品是指已知浓度或拷贝数，用于构建标准曲线的样品。为保证标准品的稳定，一般将基因片段克隆到质粒后，作为标准品。
2.标准曲线（Standard Curve）
将已知浓度的标准品进行梯度稀释（通常为5-6个稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一qPCR实验中进行反应。根据扩增曲线，以稀释标准品的Ct值为横坐标，起始拷贝数的log值为纵坐标构建。（如下图所示）理论上，稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距（两个样本Ct值差）符合等式“2n＝稀释倍数”，如：10倍稀释的样本，2n＝10，n=3.32，即Ct值差为3.32。
3.扩增效率（Amplification efficiency）
扩增效率与标准曲线的斜率相关，斜率的绝对值与荧光曲线间距相同，扩增效率计算式为E＝10-1/斜率，如果将扩增效率用百分率来表示，则E%=(E-1)×100%。一般说来，扩增效率接近 100%是重复性好的标志，然而在实际操作时，扩增效率应该在90%-105%之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；若扩增效率大于100%，可能由于稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。
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